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        基于虛擬篩選探討菲啶類衍生物抗新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)潛力

        王宜挺 樊世瑞 楊碧娟 陳鐸之 郝小江

        引用本文:
        Citation:

        基于虛擬篩選探討菲啶類衍生物抗新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)潛力

          作者簡介: 王宜挺(1996?),男,浙江人,碩士生,主要研究藥物化學. E-mail:wangyiting@mail.ynu.edu.cn;
          通訊作者: 郝小江, haoxj@mail.kib.ac.cn
        • 中圖分類號: R914.2

        Exploring the potential of phenanthridine derivatives against SARS-CoV-2based on virtual screening

          Corresponding author: HAO Xiao-jiang, haoxj@mail.kib.ac.cn
        • CLC number: R914.2

        • 摘要: 以新型冠狀病毒主蛋白酶(Mpro)和RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)為靶點,通過計算輔助,設計、篩選具有潛在抑制病毒活性的菲啶型化合物. 參考活性藥物,設計菲啶類小分子配體庫,綜合運用開放源碼分子對接軟件Autodock vina,分子三維結構顯示軟件Pymol 2.1.0,對設計的菲啶類小分子配體庫虛擬篩選,提取潛在活性化合物,進行結合模式和構效關系分析. 結果顯示數個菲啶類衍生物能分別與Mpro和RdRp較強結合,表明經過合理設計的菲啶類衍生物有抗新型冠狀病毒的潛力.
        • 圖 1  不同氧化程度菲啶母核結構

          Figure 1.  Skeleton structure of phenanthridine with different oxidation states

          圖 2  抗病毒活性的菲啶類化合物結構

          Figure 2.  The structure of phenanthridine compounds with antiviral activity

          圖 3  菲啶母核與抗SARS-CoV-2藥物結構片段相似

          Figure 3.  Phenanthridine involve in the fragment of anti-SARS-CoV-2 agents

          圖 4  菲啶類小分子配體庫的設計

          Figure 4.  Design of ligand library

          圖 5  分子對接計算結果能與共晶配體構象疊合(左:Mpro,右:RdRp)

          Figure 5.  Conformation of docking can coincide with origin ligand. (Left: Mpro, Right: RdRp)

          圖 6  M1~M4結構及與Mpro的結合模式

          Figure 6.  The structure of M1—M4 and binding mode to Mpro

          圖 7  R1~R4結構及與RdRp的結合模式

          Figure 7.  The structure of R1—R4 and binding mode to RdRp

          表 1  針對Mpro的菲啶類潛在活性化合物

          Table 1.  Hit compound of Mpro

          化合物結合力/(kJ·mol?1)化合物結合力/(kJ·mol?1)化合物結合力/(kJ·mol?1)
          M1 ?38.5 M8 ?36.8 M15 ?36.4
          M2 ?38.1 M9 ?36.8 M16 ?36.4
          M3 ?38.1 M10 ?36.8 M17 ?36.4
          M4 ?38.1 M11 ?36.8 M18 ?36.4
          M5 ?38.1 M12 ?36.8 M19 ?36.4
          M6 ?38.1 M13 ?36.8 M20 ?36.4
          M7 ?37.3 M14 ?36.8 對照 ?33.1
          下載: 導出CSV

          表 2  針對RdRp的菲啶類潛在活性化合物

          Table 2.  Hit compound of RdRp

          化合物結合力/(kJ·mol?1)化合物結合力/(kJ·mol?1)化合物結合力/(kJ·mol?1)
          R1 ?53.6 R8 ?51.5 R15 ?49.0
          R2 ?51.9 R9 ?51.1 R16 ?49.0
          R3 ?51.9 R10 ?50.7 R17 ?49.0
          R4 ?51.9 R11 ?50.7 R18 ?49.0
          R5 ?51.5 R12 ?49.4 R19 ?49.0
          R6 ?51.5 R13 ?49.4 R20 ?49.0
          R7 ?51.5 R14 ?49.0 對照 ?44.4
          下載: 導出CSV
          幸运快三
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        出版歷程
        • 收稿日期:  2020-06-09
        • 錄用日期:  2020-07-24
        • 網絡出版日期:  2020-09-30
        • 刊出日期:  2020-11-10

        基于虛擬篩選探討菲啶類衍生物抗新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)潛力

          作者簡介:王宜挺(1996?),男,浙江人,碩士生,主要研究藥物化學. E-mail:wangyiting@mail.ynu.edu.cn
          通訊作者: 郝小江, haoxj@mail.kib.ac.cn
        • 1. 云南大學 化學科學與工程學院·藥學院,云南 昆明 650091
        • 2. 中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室,云南 昆明 650201

        摘要: 以新型冠狀病毒主蛋白酶(Mpro)和RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)為靶點,通過計算輔助,設計、篩選具有潛在抑制病毒活性的菲啶型化合物. 參考活性藥物,設計菲啶類小分子配體庫,綜合運用開放源碼分子對接軟件Autodock vina,分子三維結構顯示軟件Pymol 2.1.0,對設計的菲啶類小分子配體庫虛擬篩選,提取潛在活性化合物,進行結合模式和構效關系分析. 結果顯示數個菲啶類衍生物能分別與Mpro和RdRp較強結合,表明經過合理設計的菲啶類衍生物有抗新型冠狀病毒的潛力.

        English Abstract

        • 新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是引起新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的病原體,因其基因組與SARS冠狀病毒高度相似,國際病毒分類委員會將其命名為SARS-CoV-2[1]. 截至2020年10月底,全球新型冠狀病毒肺炎確診病例超過3000萬例,死亡人數超過100萬,已發展為全球性的大流行病. 面對SARS-CoV-2肆虐,研究人員緊急攻關,發現了一些有效或潛在有效的抗病毒藥物[2],如法匹拉韋、瑞德西韋、洛匹那韋/利托那韋、磷酸氯喹,槲皮素等[3-4]. 然而,目前仍未有特異性藥物和疫苗問世[5].

          在SARS-CoV-2侵染宿主細胞的過程中,病毒的多聚蛋白經過主蛋白酶(Mpro,也稱做3C樣蛋白酶,3CLpro)的酶切作用,形成16種非結構性蛋白(nsps),這些nsps是編碼4種主要結構蛋白[包膜蛋白(E),膜蛋白(M),棘突蛋白(S),核衣殼蛋白(N)]的RNA合成過程的參與者. 抑制Mpro的活性,將有效控制病毒的增殖,此外人體中不存在與Mpro同源的蛋白,因而Mpro是一個理想的抗病毒靶點[6];nsp12是病毒多聚蛋白經酶切作用后的一種非結構蛋白產物,它催化病毒RNA的合成,是病毒RNA轉錄過程中的成員,稱為RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp),在病毒復制和轉錄過程中扮演了重要角色使其成為又一有價值的抗病毒靶點[7].

          計算機虛擬篩選被廣泛應用于現代藥物前期開發,虛擬篩選依賴于可靠的藥物作用靶點和豐富的化合物庫,高質量地虛擬篩選可迅速鎖定目標,引導后續應對策略的制定[8]. 其中分子對接技術可以預測小分子配體與受體生物大分子相互作用,從而初步篩選潛在活性化合物. 面對突發性疾病,如此次SARS-CoV-2的爆發,虛擬篩選無疑是一種非常重要的抗病毒先導化合物發現手段.

          菲啶是一種含氮雜環,根據其氧化狀態不同,分別為菲啶酮、菲啶和二氫菲啶3種類型,其結構如圖1所示,為許多活性分子的骨架核心[9]. 其衍生物展現出了廣泛的藥理活性作用,如抗病毒、抗菌、抗真菌和抗細胞增殖等[10],尤其在抗病毒作用方面,菲啶類衍生物表現出了良好活性,圖2列舉了一些抗病毒活性的菲啶類分子結構. 文獻報道天然產物石蒜堿1具有廣譜抗病毒作用[11];菲啶酮衍生物化合物2具有抗HCV作用[12];其EC50=0.05 μmol/L;二氫菲啶衍生物化合物3有較強抗HBV,HCV作用,并且細胞毒性很小[13];專利報道菲啶鎓鹽化合物4能抑制多種逆轉錄病毒復制[14];化合物5有抗煙草花葉病毒作用[15]. 目前臨床使用的抗SARS-CoV-2藥物以及科研人員篩選出的一些在體內外具有良好活性的化合物,其結構與菲啶環具有一些相似性(圖3),基于此,我們推測菲啶類衍生物可能會與SARS-CoV-2相關靶蛋白有較好的相互作用,能干擾SARS-CoV-2感染宿主細胞過程,從而抑制SARS-CoV-2復制. 我們選取了Mpro和RdRp作為藥物干預的靶點結構,采用虛擬篩選技術,對一批菲啶類化合物進行了虛擬篩選,探討菲啶類衍生物抗病毒的潛力,為新型抗SARS-CoV-2藥物的研發提供一些線索.

          圖  1  不同氧化程度菲啶母核結構

          Figure 1.  Skeleton structure of phenanthridine with different oxidation states

          圖  2  抗病毒活性的菲啶類化合物結構

          Figure 2.  The structure of phenanthridine compounds with antiviral activity

          圖  3  菲啶母核與抗SARS-CoV-2藥物結構片段相似

          Figure 3.  Phenanthridine involve in the fragment of anti-SARS-CoV-2 agents

          • PDB數據庫(RCSB Protein Data Bank);菲啶類小分子配體庫;Autodock vina分子對接軟件[16];Pymol 2.1.0分子三維結構顯示軟件;Chembio Office化學結構編輯軟件;Visual Studio Code腳本編輯軟件.

          • 在PDB數據庫和2019-nCoV藥物靶標結構信息共享平臺下載SARS-CoV-2主蛋白酶(PDB:6lze)和RNA依賴的RNA聚合酶的三維結構數據,在Pymol中分別打開PDB文件,輸入extract ligand,sele 命令提取晶體結構中的共晶配體,保存其共結晶構象PDB格式配體文件,用于比對分子對接算法的準確性;輸入remove solvent,remove organic 命令,除去蛋白晶體中的溶劑和小分子,保存為PDB格式受體文件待用. 將受體文件導入Autodock tool 1.5.6,執行受體加極性氫,計算Gasteiger電荷操作,兼顧對接計算的準確度與計算效率,擬采用半柔性對接方式,受體設置為剛性,輸出為受體PDBQT文件,用于分子對接計算.

          • 虛擬篩選配體庫應當具有多樣性,參考具有抗病毒活性的菲啶類分子,我們主要針對菲啶母核的3, 4, 5, 6, 8, 9號位進行設計衍生化(圖4). 根據C,N,O元素連接菲啶母核的不同,將菲啶類衍生物設計為 9大類菲啶母核亞型(A~I),接著選取15種成藥分子中常出現的藥效基團結構1~15,分別對9種菲啶母核亞型進行不同的片段連接,從而形成了結構足夠豐富的約500個菲啶類配體庫. 將所有小分子3D結構繪制在Chembiooffice中,進行能量最小化處理,導出為mol2格式文件,利用腳本程序raccoon.bat將配體結構分離為單個結構mol2文件,并將其批量制備成對接軟件需要的PDBQT文件待用[17].

            圖  4  菲啶類小分子配體庫的設計

            Figure 4.  Design of ligand library

          • 在Autodock tool 1.5.6分別打開已制備好的SARS-CoV-2主蛋白酶和RNA依賴的RNA聚合酶及其配體的PDBQT文件,通常經驗認為將對接位點設置為以配體為中心,往配體四周擴展0.9 nm距離,能包含住與配體相互作用的氨基酸殘基,并且能取得較準確的對接構象. 因而我們設置對接位點中心為配體的質心坐標,設置對接位點的距離為2.5 nm,在軟件中體現為Grid Box參數設置為Spacing (angstrom)=1,number of point =25,Grid Box中心為配體質心坐標,用Visual Studio Code軟件編寫Autodock vina運行所需要的腳本文件,執行運算. 將運行結果文件在Pymol中打開,同時打開提取的共晶配體構象文件,對比發現計算結果中的最優構象能與共晶配體構象基本重合(圖5). 說明進行分子對接的算法和參數設置可靠,可進行虛擬篩選實驗.

            圖  5  分子對接計算結果能與共晶配體構象疊合(左:Mpro,右:RdRp)

            Figure 5.  Conformation of docking can coincide with origin ligand. (Left: Mpro, Right: RdRp)

          • 經過以上實驗步驟,結果表明所設置分子對接參數能夠用于虛擬篩選,我們使用Visual Studio Code軟件編寫虛擬篩選以及排序各個化合物最優構象結合力的腳本,以靶蛋白中的共晶配體作為陽性對照,執行虛擬篩選實驗,提取化合物的結合力數據. 分別選取與SARS-CoV-2主蛋白酶和RNA依賴的RNA聚合酶結合力最強的前5%的20個化合物作為潛在活性化合物,將結合能數據列表展示;在Pymol中利用配體?受體相互作用腳本,展示結合力前1%的4個化合物與靶點蛋白活性位點氨基酸殘基的相互作用;總結菲啶類衍生物分別與Mpro和RdRp結合的構效關系.

          • 將菲啶類配體庫與SARS-CoV-2主蛋白酶的活性位點進行對接,實驗結果發現近50%的化合物其結合力強于/等于陽性對照分子,說明這些菲啶類化合物普遍與SARS-CoV-2主蛋白酶結合口袋具有良好的適配性,能形成結構穩定的復合物. 將結合力進行排序,列出了前5%的化合物,將其視為潛在活性化合物(表1),可以看出其結合力顯著強于陽性對照化合物;并對前1% 的化合物進行了結合模式分析(圖6),發現該類化合物大多能與Ser144,Cys145, Glu166氨基酸發生氫鍵相互作用,主要由8,9位取代的藥效基團的極性原子和4位的酰胺氮原子產生;菲啶母核及取代的藥效基團中的芳香環則用于形成π?π堆積等疏水性相互作用;在Pymol中將靶點蛋白以surface模式顯示,可以看見結合口袋顯示為典型的凹槽狀,將凹槽分為4個區域:P1~P4,可以看到M1,M2,M3,M4能緊緊地占據蛋白凹槽的4個部位,這也為進一步的化合物修飾提供了更多信息. 一方面可能是菲啶母核本身能較好地容納在受體結合口袋中;另一方面所設計的菲啶類化合物,其側鏈取代多為上市藥物中常出現的藥效團結構,這可能為增強受體與配體之間的結合力做了貢獻.

            化合物結合力/(kJ·mol?1)化合物結合力/(kJ·mol?1)化合物結合力/(kJ·mol?1)
            M1 ?38.5 M8 ?36.8 M15 ?36.4
            M2 ?38.1 M9 ?36.8 M16 ?36.4
            M3 ?38.1 M10 ?36.8 M17 ?36.4
            M4 ?38.1 M11 ?36.8 M18 ?36.4
            M5 ?38.1 M12 ?36.8 M19 ?36.4
            M6 ?38.1 M13 ?36.8 M20 ?36.4
            M7 ?37.3 M14 ?36.8 對照 ?33.1

            表 1  針對Mpro的菲啶類潛在活性化合物

            Table 1.  Hit compound of Mpro

            圖  6  M1~M4結構及與Mpro的結合模式

            Figure 6.  The structure of M1—M4 and binding mode to Mpro

            綜合觀察所有配體與Mpro的結合情況,初步判斷菲啶環的4, 5, 8, 9位的改變對結合力的影響至關重要,4號位取代各類位阻較大的藥效基團并不能明顯提升結合力,適合連接一些小體積的極性基團如乙酰氨基,乙酰氨甲基等,提供氫鍵受體原子或供體氫原子,同時得以順利占據口袋;母核以菲啶形式存在較好,可能是由于能形成大芳環共軛,有利于疏水作用形成,而菲啶酮和5號位有位阻較大取代的二氫菲啶,不容易伸入蛋白口袋中去,因此5號位不應作為藥效基團的取代位點,適合連接如甲基、乙基等小體積基團;8, 9號位是藥效基團連接的理想位置,從篩選結果來看,8.9位以氧原子連接為佳,通常將菲啶母核結構與藥效團以氧甲基相連(—OCH2—),使得8, 9位的藥效基團能有更大的轉動范圍,利于分子與口袋中氨基酸殘基的相互作用,連接基團以含氮雜環、酰胺基、磺?;群袠O性氫或電負性較強的原子為好,藥效基團體積可以稍大,因此對菲啶類化合物的改造,8, 9號位至關重要. 我們認為通過適當地修飾,菲啶類化合物很有潛力成為優良的Mpro抑制劑.

          • 本研究以瑞德西韋(Remdesivir)作為陽性對照,研究表明該化合物在體外對SARS-CoV-2具有較強的抑制作用[18]. 其作用機制是,瑞德西韋經體內代謝后,形成NTP,可以插入SARS-CoV-2的RNA依賴的RNA聚合酶的活性位點[19],從而干擾該酶的正常催化,起到抑制病毒復制的作用. NTP的磷酸基團可與酶中的鎂離子形成配位. 將NTP與RdRp進行分子對接發現其結合能為?44.4 kJ/mol,一般認為結合能數值小于?30.0 kJ/mol就具有不錯的結合效果,說明瑞德西韋代謝產物確實與RdRp之間有很強的結合力,菲啶母核具有NTP類似的雜環芳烴片段,這提示菲啶類化合物或許能很好地結合RdRp. 我們以RdRp作為靶點,對菲啶類配體庫進行了虛擬篩選,發現了多個比瑞德西韋代謝產物與RdRp結合更好的化合物,其比例達到20%,單純的菲啶母核其結合力也達到了?31.0 kJ/mol. 對結合力排序在前5%的分子進行列表展示,作為潛在活性化合物(表2),可以看到其結合力比陽性對照還強很多,推測菲啶類化合物在抑制RdRp方面有不錯的應用前景. 將結合力最強的4個分子進行結合模式分析(圖7),發現分子對接后的苯并噻吩,吲哚基團處于NTP的芳香雜環區域,并且幾乎處于同一平面,這可能是9元雜環芳烴與堿基等形成疏水作用時的優勢構象,芳香環中雜原子則能與殘基形成氫鍵作用;配體的 8, 9位氧原子與Arg437,Arg437形成氫鍵,當4號位以酰胺形式取代時,常與Cys697,Ser698形成氫鍵,此外該酶為RNA依賴的聚合酶,合成RNA時,一些堿基能與菲啶母核形成π?π堆積作用,加強了配體與受體之間的相互作用.

            化合物結合力/(kJ·mol?1)化合物結合力/(kJ·mol?1)化合物結合力/(kJ·mol?1)
            R1 ?53.6 R8 ?51.5 R15 ?49.0
            R2 ?51.9 R9 ?51.1 R16 ?49.0
            R3 ?51.9 R10 ?50.7 R17 ?49.0
            R4 ?51.9 R11 ?50.7 R18 ?49.0
            R5 ?51.5 R12 ?49.4 R19 ?49.0
            R6 ?51.5 R13 ?49.4 R20 ?49.0
            R7 ?51.5 R14 ?49.0 對照 ?44.4

            表 2  針對RdRp的菲啶類潛在活性化合物

            Table 2.  Hit compound of RdRp

            圖  7  R1~R4結構及與RdRp的結合模式

            Figure 7.  The structure of R1—R4 and binding mode to RdRp

            綜合觀察菲啶類配體庫與RdRp的對接情況,我們認為如吲哚、苯并噻吩、嘌呤等9元雜環芳烴片段在與RdRp的結合過程中會起到大作用,在結合力小于?46.0 kJ/mol的菲啶類配體中,大多出現了以上基團;菲啶母核是理想的伸入活性口袋的母核結構,同時也可能會與堿基形成共軛堆積,產生較強的疏水作用;5號位的取代宜考慮位阻較小的基團,如甲基、乙基、甲酰胺基等,當5號位取代大位阻官能團時,其結合力較弱;4號位是可以增效的取代位點,適合連接一些極性片段,如乙酰氨甲基、環戊酰胺基、丁二酰亞胺基等,8, 9號位對結合力影響甚大,從結果看,連接多元雜芳環或許是不錯的選擇.

          • 新型冠狀病毒席卷全球,新型抗病毒藥物發現迫在眉睫. 不少菲啶類化合物曾被報道具有良好的抗病毒作用,我們為此展開了菲啶類化合物的虛擬篩選實驗. 菲啶母核因其氧化程度不同,本身具有多樣性,對其母核進行藥效基團衍生,形成了高質量的配體庫;通過虛擬篩選菲啶類配體庫,我們發現了一系列有前景的潛在活性分子,這些分子分別與新型冠狀病毒的主蛋白酶和RNA依賴的RNA聚合酶有強的結合效果;有意思的是,以相同的配體庫進行2個不同靶點蛋白的虛擬篩選,篩選得到的2類潛在活性化合物雖具有共同母核結構,但與2個靶點蛋白同時命中的分子卻很少,這意味著對于不同的靶點,潛在活性化合物表現出一定的特異性,因此菲啶類衍生物有潛力發展為靶向的病毒抑制劑,起到抗新型冠狀病毒的作用. 潛在活性分子的結構不甚復雜,為化合物的制備帶來了便利,下一步我們將對這些潛在活性分子進行化學合成,在細胞層面驗證這些分子的抗病毒作用,為抗SARS-CoV-2的藥物研發提供一些線索.

        參考文獻 (19)

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