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        云南異龍湖可培養酵母菌多樣性及產胞外酶和油脂活性菌株篩選

        李治瀅 董明華 周斌 楊麗源 賴泳紅 王永霞 肖煒 崔曉龍 李紹蘭

        引用本文:
        Citation:

        云南異龍湖可培養酵母菌多樣性及產胞外酶和油脂活性菌株篩選

          作者簡介: 李治瀅(1969?),女,云南人,高級實驗師,主要研究方向為真菌分類及其應用;
          通訊作者: 李紹蘭, shlli@ynu.edu.cn
        • 中圖分類號: Q939

        Biodiversity of culturable yeasts isolated from Yilong Lake and screening of extracellular enzyme and oil strain

          Corresponding author: LI Shao-lan, shlli@ynu.edu.cn
        • CLC number: Q939

        • 摘要: 異龍湖是富營養高原湖泊,對其酵母菌多樣性及產胞外酶和油脂活性菌株進行研究,了解酵母菌在異龍湖中的分布及探討酵母菌參與湖泊有機物的循環作用. 研究采用膜過濾平置法分離異龍湖水樣中的酵母菌,應用26S rRNA D1/D2區域序列分析和形態特征及生理生化指標相結合的方法對酵母菌進行鑒定,運用BIO-DAP分析酵母菌的多樣性,采用胞外酶定性篩選培養基進行產酶活性菌株篩選,利用蘇丹黑-B染色和DNS分光光度法測定殘糖含量相結合的方法篩選產油脂活性菌株. 結果表明:從異龍湖湖水中分離獲得288株酵母菌,歸屬26個屬41個種3個潛在的新類群;優勢種為Rhodotorula kratochvilovae、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、Candida tetrigidarumFilobasidium magnum;湖西水樣的酵母菌多樣性指數(H′)和物種豐富度比湖東低;大多數菌株至少具有1種胞外酶活性(主要是脂肪酶、果膠酶和淀粉酶活性);篩選獲得20株具有油脂活性的菌株,活性菌株主要分布在紅酵母屬(Rhodotorula). 研究表明異龍湖具有豐富的酵母菌多樣性,貯藏大量值得開發利用的酵母菌資源.
        • 圖 1  基于 26S rRNA D1/D2 區域序列構建的系統樹(Neighbor-Joining 法)

          Figure 1.  Phylogenetic tree drawn from Neighbor-Joining analysis based on the 26S rRNA D1/D2 domain sequence alignment

          表 1  異龍湖的采樣點信息

          Table 1.  The basic information of sampling points in Yilong Lake

          樣點編號采樣地點經度緯度
          YL-1壩心鎮以西湖心102°37′38″E23°39′29″N
          YL-2石缸村以西湖心102°37′27″E23°39′40″N
          YL-3沙咀村以西湖心102°37′5″E23°39′47″N
          YL-4小窩鋪村以西湖心102°36′28″E23°40′10″N
          YL-5龍灣廟村以北湖心102°35′54″E23°40′30″N
          YL-6大過細村以北湖心102°35′2″E23°40′39″N
          YL-7仁壽村與長咀村
          之間湖心
          102°34′10″E23°40′11″N
          YL-8仁壽村與白浪村
          之間湖心
          102°33′34″E23°40′15″N
          YL-9仁壽村以東湖心102°34′44″E23°41′19″N
          下載: 導出CSV

          表 2  異龍湖湖水各樣點酵母菌種群分布

          Table 2.  The distribution of yeast species at sample-sites in Yilong Lake

          種名采樣點合計分離頻率/%
          YL-1YL-2YL-3YL-4YL-5YL-6YL-7YL-8YL-9
          Basidiomycota yeasts
          Bullera alba 1 1 1 3 1.04
          Bullera sinensis 1 1 1 3 1.04
          Filobasidium floriforme 3 2 1 1 1 2 10 3.47
          Filobasidium magnum 1 5 2 9 1 2 20 6.94
          Filobasidium uniguttulatum 1 1 2 0.69
          Hannaella zeae 3 1 4 1.39
          Microstroma bacarum 1 1 0.35
          Naganishia albida 7 7 2.43
          Papiliotrema aspenensis 1 3 1 5 1.74
          Papiliotrema flavescens 4 1 2 7 2.43
          Papiliotrema fuscus 5 5 1.74
          Papiliotrema rajasthanensis 1 1 0.35
          Cryptococcus sp. 1 3 2 6 2.08
          Rhodotorula babjevae 1 1 0.35
          Rhodotorula glutinis 1 1 0.35
          Rhodotorula graminis 8 1 5 2 16 5.56
          Rhodotorula kratochvilovae 1 3 17 12 3 9 6 51 17.71
          Rhodotorula mucilaginosa 4 4 1.39
          Rhodotorula taiwanensis 1 1 5 7 2.43
          Rhodotorula sp. 1 1 0.35
          Saitozyma flava 2 2 0.69
          Sakaguchia dacryoidea 1 2 3 1.04
          Sampaiozyma ingeniosa 2 2 0.69
          Sampaiozyma vanillica 2 2 0.69
          Sporidiobolus pararoseus 1 1 0.35
          Sporobolomyces oryzicola 1 1 0.35
          Symmetrospora marina 1 1 0.35
          Ascomycota yeasts
          Barnettozyma californica 10 1 4 15 5.21
          Candida railenensis 1 1 0.35
          Candida tetrigidarum 1 3 4 13 21 7.29
          Candida tropicalis 1 1 0.35
          Candida sp. 1 1 1 3 1.04
          Clavispora lusitaniae 1 1 0.35
          Debaryomyces nepalensis 1 1 0.35
          Diutina catenulata 4 1 5 1.74
          Geotrichum bryndzae 1 2 3 1.04
          Hanseniaspora uvarum 2 2 0.69
          Lodderomyces elongisporus 1 1 0.35
          Meyerozyma guilliermondii 1 1 2 0.69
          Pichia cactophila 3 3 6 2.08
          Pichia kudriavzevii 1 1 2 0.69
          Saturnispora silvae 3 3 6 2.08
          Wickerhamomyces anomalus 1 1 0.35
          Yeast-like taxa
          Aureobasidium pullulans 8 8 2 3 1 2 1 14 3 42 14.58
          Unidentified 2 4 1 1 8 2.78
          合計 43 42 38 64 29 16 14 29 13 288
          物種豐富度 17 14 18 20 10 4 5 6 5
          香農指數 (H) 2.48 2.21 2.71 2.65 1.56 0.82 1.33 1.32 1.38
          辛普森指數 (D) 0.089 0.127 0.051 0.080 0.342 0.558 0.275 0.318 0.244
          下載: 導出CSV

          表 3  異龍湖酵母菌的胞外酶活性

          Table 3.  Extracellular enzymatic activities of yeasts from Yilong Lake

          種名25 ℃5 ℃合計
          ABCDEF小計ABCDEF小計
          Basidiomycetous yeasts
          Cryptococcus sp. 1 1 1 0 1
          Filobasidium floriforme 1 1 1 0 1
          Filobasidium magnum 12 5 2 1 12 0 12
          Filobasidium uniguttulatum 1 1 0 1
          Hannaella zeae 2 1 2 0 2
          Naganishia albida 4 3 2 5 0 5
          Papiliotrema aspenensis 3 2 1 4 0 4
          Papiliotrema flavescens 4 1 4 0 4
          Papiliotrema fuscus 2 2 2 0 2
          Rhodotorula glutinis 1 1 1 0 1
          Rhodotorula graminis 7 1 1 8 1 1 1 1 1 8
          Rhodotorula kratochvilovae 8 5 3 14 1 1 1 15
          Rhodotorula taiwanensis 1 1 1 0 1
          Saitozyma flava 1 1 0 1
          Sakaguchia dacryoidea 0 1 1 1
          Sampaiozyma vanillica 0 1 1 1 1 1 1 1
          Ascomycetous yeasts
          Barnettozyma californica 1 2 1 1 3 1 3 3 6
          Candida tetrigidarum 1 1 2 0 2
          Candida tropicalis 1 1 0 1
          Debaryomyces nepalensis 1 1 0 1
          Diutina catenulata 1 1 0 1
          Geotrichum bryndzae 0 1 1 1 1 1
          Lodderomyces elongisporus 0 1 1 1
          Yeast-like taxa
          Aureobasidium pullulans 1 2 1 3 2 2 3 2 3 6
          Unidentified 1 1 2 1 1 1 3
          合計 42 30 16 3 5 2 70 5 6 12 0 3 3 13 82
          A:脂肪酶活性;B:果膠酶活性;C:淀粉酶活性;D:纖維素酶活性;E:植酸酶活性;F:蛋白酶活性.
          下載: 導出CSV

          表 4  異龍湖產油脂酵母菌篩選結果

          Table 4.  Initial screening results of lipid–producing yeasts from Yilong Lake

          菌株編號種名殘糖/%菌株編號種名殘糖/%
          Basidiomycetous yeastsAscomycetous yeasts
          Ym26448Cryptococcus sp.1.01Ym26336Barnettozyma californica0.58
          Ym26410Filobasidium magnum0.61Ym26343Barnettozyma californica1.11
          Ym26423Papiliotrema aspenensis0.84Ym26496Candida railenensis0.91
          Ym26369Papiliotrema flavescens1.22Ym26318Meyerozyma guilliermondii0.81
          Ym26338Rhodotorula glutinis1.11Ym26358Pichia kudriavzevii1.38
          Ym26316Rhodotorula graminis1.13
          Ym26319Rhodotorula graminis0.95
          Ym26444Rhodotorula graminis1.02
          Ym26443Rhodotorula kratochvilovae0.81
          Ym26450Rhodotorula kratochvilovae1.42
          Ym26466Rhodotorula kratochvilovae1.00
          Ym26359Rhodotorula taiwanensis0.25
          Ym26388Rhodotorula taiwanensis0.34
          Ym26400Rhodotorula taiwanensis0.43
          Ym26427Rhodotorula taiwanensis0.35
          下載: 導出CSV
          幸运快三
        • [1] Tant C J, Rosemond A D, Mehring A S, et al. The role of aquatic fungi in transformations of organic matter mediated by nutrients[J]. Freshwater Biology, 2015, 60(7): 1 354-1 363. DOI:  10.1111/fwb.12573.
          [2] Shearer C A, Descals E, Kohlmeyer B, et al. Fungal biodiversity in aquatic habitats[J]. Biodiversity & Conservation, 2007, 16(1): 49-67. DOI:  10.1007/s10531-006-9120-z.
          [3] Boekhout T, Robert V, Smith M T, et al. Yeasts of the world: Morphology, physiology, sequences and identification[M]. Berlin: Springer, 2002.
          [4] Rosa C A, Resende M A, Barbosa F A R, et al. Yeast diversity in a mesotrophic lake on the karstic plateau of Lagoa Santa, MG-Brazil[J]. Hydrobiologia, 1995, 308(2): 103-108. DOI:  10.1007/BF00007394.
          [5] Libkind D, Moline M, Sampaio J P, et al. Yeasts from high-altitude lakes: Influence of UV radiation[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2009, 69(3): 353-362. DOI:  10.1111/j.1574-6941.2009.00728.x.
          [6] Brand?o L R, Libkind D, Vaz A B, et al. Yeasts from oligotrophic lake in Patagonia (Argentina): Diversity, distribution and synthesis of photoprotective compounds and extracellular enzymes[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2011, 76(1): 1-13. DOI:  10.1111/j.1574-6941.2010.01030.x.
          [7] Russo G, Libkind D, Sampaio J P, et al. Yeast diversity in the acidic Rio Agrio-Lake Caviahue volcanic environment (Patagonia, Argentina)[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2008, 65(3): 415-424. DOI:  10.1111/j.1574-6941.2008.00514.x.
          [8] 鄭曉吉, 孫海龍, 關波, 等. 天山一號冰川融水中耐冷酵母菌多樣性及系統發育[J]. 食品與發酵工業, 2015, 41(7): 45-50. DOI:  10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201507009. Zheng X J, Sun H L, Guan B, et al. Diversity and phylogeny of cold-adapted yeast from melt-water in the No. 1 Glacier, Tianshan Mountains[J]. Food and Fermentation Industries, 2015, 41(7): 45-50.
          [9] 郭小芳, 李治瀅, 董明華, 等. 云南高原湖泊撫仙湖酵母菌空間分布及其與環境因子的關系[J]. 湖泊科學, 2016, 28(2): 358-369. DOI:  10.18307/2016.0216. Guo X F, Li Z Y, Dong M H, et al. Spatial dynamics of yeast community and its relationship to environmental factors in Fuxian Lake, Yunnan Province[J]. J Lake Sci, 2016, 28(2): 358-369.
          [10] 樊竹青, 李治瀅, 董明華, 等. 云南撫仙湖產類胡蘿卜素酵母菌的資源調查[J]. 微生物學通報, 2017, 44(2): 296-304. DOI:  10.13344/j.microbiol.china.160078. Fan Z Q, Li Z Y, Dong M H, et al. Carotenoid-producing yeasts resources in Fuxian Lake, Yunnan[J]. Microbiology China, 2017, 44(2): 296-304.
          [11] 譚金連, 李治瀅, 周斌, 等. 云南高原湖泊撫仙湖和星云湖的酵母菌胞外酶活性[J]. 微生物學通報, 2018, 45(2): 302-313. DOI:  10.13344/j.microbiol.china.170262. Tan J L, Li Z Y, Zhou B, et al. Extracellular enzymatic activities of yeasts isolated from Fuxian Lake and Xingyun Lake in Yunnan Plateau[J]. Microbiology China, 2018, 45(2): 302-313.
          [12] 譚金連. 滇中三個高原湖泊的產胞外酶活性酵母菌多樣性研究[D]. 昆明: 云南大學, 2018.

          Tan J L. Diversity of extracellular enzymatic activities and producing enzymatic conditions optimization of yeasts isolated from three plateau lakes in central Yunnan Province [D]. Kunming: Yunnan University, 2018.
          [13] 李治瀅, 樊竹青, 董明華, 等. 云南星云湖酵母菌多樣性及產類胡蘿卜素的評價[J]. 微生物學通報, 2019, 46(6): 1 309-1 319. DOI:  10.13344/j.microbiol.china.180489. Li Z Y, Fan Z Q, Dong M H, et al. Diversity and evaluation of carotenoids-producing of yeasts isolated from Xingyun Lake[J]. Microbiology China, 2019, 46(6): 1 309-1 319.
          [14] 李治瀅, 周新麗, 周斌, 等. 云南程海湖冬季酵母菌多樣性及胞外酶活性研究[J]. 菌物學報, 2017, 36(2): 177-185. DOI:  10.13346/j.mycosystema.150238. Li Z Y, Zhou X L, Zhou B, et al. Diversity and extracellular enzymes of yeasts from Chenghai Lake in winter[J]. Mycosystema, 2017, 36(2): 177-185.
          [15] 周新麗, 李治瀅, 楊麗源, 等. 云南程海湖酵母菌多樣性及應用[J]. 微生物學報, 2010, 51(4): 547-553. DOI:  10.13343/j.cnki.wsxb.2011.04.018. Zhou X L, Li Z Y, Yang L Y, et al. Identification of yeasts isolated from Chenghai Lake, a plateau lake in Yunnan Province[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2010, 51(4): 547-553.
          [16] 董明華, 李治瀅, 周斌, 等. 云南高原湖泊杞麓湖冬季可培養酵母菌多樣性分析[J]. 微生物學報, 2016, 56(4): 603-613. DOI:  10.13343/j.cnki.wsxb.20150271. Dong M H, Li Z Y, Zhou B, et al. Diversity of cultivable yeast in Qiluhu Lake in winter[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2016, 56(4): 603-613.
          [17] 嚴亞萍, 李治瀅, 董明華, 等. 云南陽宗海酵母菌種群結構及產胞外酶測試[J]. 微生物學報, 2013, 53(11): 1 205-1 212. DOI:  10.13343/j.cnki.wsxb.2013.11.004. Yan Y P, Li Z Y, Dong M H, et al. Yeasts from Yangzonghai Lake in Yunnan (China): Diversity and extracellular enzymes[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2013, 53(11): 1 205-1 212.
          [18] 嚴亞萍. 云南洱海和陽宗海酵母菌多樣性研究及活性菌株評價[D]. 昆明: 云南大學, 2013.

          Yan Y P. Diversity of yeast and evaluation of active strains of Erhai Lake and Yangzonghai Lake in Yunnan Province[D]. Kunming: Yunnan University, 2013.
          [19] 韓龍. 云南高原湖泊滇池的真菌多樣性及其空間分布特征[D]. 昆明: 云南大學, 2018.

          Han L. Diversity and spatial distribution of fungi in Dianchi Lake of Yunnan Plateau[D]. Kunming: Yunnan University, 2018.
          [20] 劉薇, 寧平, 孫鑫, 等. 異龍湖水質及水生生態系統演變趨勢[J]. 環境科學與技術, 2018, 41(S1): 281-287. DOI:  10.19672/j.cnki.1003-6504.2018.S1.051. Liu W, Ning P, Sun X, et al. The evolution tendency of water quality and aquatic system in Lake Yilong[J]. Environmental Science & Technology, 2018, 41(S1): 281-287.
          [21] 李杰, 陳靜, 趙磊. 異龍湖藻類群落特征及環境響應關系[J]. 環境科學與技術, 2014, 37(120): 58-61. Li J, Chen J, Zhao L. Phytoplankton population response of water environmental index in Yilong Lake[J]. Environmental Science & Technology, 2014, 37(120): 58-61.
          [22] 王振方, 張瑋, 楊麗, 等. 異龍湖不同湖區浮游植物群落特征及其與環境因子的關系[J]. 環境科學, 2019, 40(5): 2 249-2 257. DOI:  10.13227/j.hjkx.201810157. Wang Z F, Zhang W, Yang L, et al. Characteristics of phytoplankton community and its relationship with environmental factors in different regions of Yilong Lake, Yunnan Province, China[J]. Environmental Science, 2019, 40(5): 2 249-2 257.
          [23] 李春筱, 劉婷婷, 劉玉珊, 等. 云南高原異龍湖噬藻體psbA基因遺傳多樣性研究[J]. 生態與農村環境學報, 2019, 35(10): 1 322-1 329. DOI:  10.19741/j.issn.1673-4831.2018.0774. Li C X, Liu T T, Liu Y S, et al. Phylogenetic diversity of cyanophage psbA gene in the plateau eutrophic Yilong Lake in Yunnan Province[J]. Journal of Ecology and Rural Environment, 2019, 35(10): 1 322-1 329.
          [24] 周虹霞, 劉衛云, 孔德平, 等. 異龍湖濕地大型水生植物群落特征分析[J]. 環境科學與技術, 2016, 39(9): 199-203. Zhou H X, Liu W Y, Kong D P, et al. Community features of aquatic macrophytes in wetland of Yilong Lake[J]. Environmental Science & Technology, 2016, 39(9): 199-203.
          [25] 華寶玉, 林娟, 嚴芬, 等. 產果膠酶菌株的篩選鑒定及其產酶條件的研究[J]. 福州大學學報: 自然科學版, 2012, 40(3): 412-417. Hua B Y, Lin J, Yan F, et al. Screening and identification of pectinase-producing strains and studying on the enzyme-producing conditions[J]. Journal of Fuzhou University: Natural Science Edition, 2012, 40(3): 412-417.
          [26] 相光明, 趙祥穎, 劉建軍, 等. 高產油脂酵母菌株的篩選[J]. 山東食品發酵, 2008, 151(4): 9-12. Xiang G M, Zhao X Y, Liu J J, et al. Screening of Yeasts High-yielding Lipid[J]. Shandong Food Fermentation, 2008, 151(4): 9-12.
          [27] Kurtzman C P, Fell J W, Boekhout T. The yeast: A taxonomic study[M]. 5th ed. London: Elsevier Science, 2011.
          [28] Nisiotou A A, Spiropoulos A E, Nychas G J E. Yeast community structures and dynamics in healthy and botrytis-affected grape must fermentations[J]. Appled and Enviornment Microbiology, 2007, 73(21): 6 705-6 713. DOI:  10.1128/AEM.01279-07.
          [29] Fell J W, Noekhout T, Fonseca A, et al. Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2000, 50(3): 1 351-1 371. DOI:  10.1099/00207713-50-3-1351.
          [30] Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology and Evolution, 1987, 4(4): 406-425. DOI:  10.1093/oxfordjournals.molbev.a040454.
          [31] Larkin M A, Blackshields G, Brown N P, et al. Clustal W and Clustal X version 2.0[J]. Bioinformatics, 2007, 23(21): 2 947-2 948. DOI:  10.1093/bioinformatics/btm404.
          [32] Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): 2 731-2 739. DOI:  10.1093/molbev/msr121.
          [33] Liu X Z, Wang Q M, G?ker M, et al. Towards an integrated phylogenetic classification of the tremellomycetes[J]. Studies in Mycology, 2015, 81: 85-147. DOI:  10.1016/j.simyco.2015.12.001http://c.wanfangdata.com.cn/periodical/hjgcjsxb/2012-4.aspx.
          [34] Wang Q M, Yurkov A M, G?ker M, et al. Phylogenetic classification of yeasts and related taxa within pucciniomycotina[J]. Studies in Mycology, 2015, 81: 149-189. DOI:  10.1016/j.simyco.2015.12.002.
          [35] Wang Q M, Begerow D, Groenewald M, et al. Multigene phylogeny and taxonomic revision of yeasts and related fungi in the Ustilaginomycotina[J]. Studies in Mycology, 2015, 81: 55-83. DOI:  10.1016/j.simyco.2015.10.004.
          [36] 白毓謙, 方善康, 高東, 等. 微生物實驗技術[M]. 濟南: 山東大學出版社, 1987.

          Bai Y Q, Fang S K, Gao D, et al. Microbial experiment technology[M]. Jinan: Shandong University Press, 1987.
          [37] 諸葛健, 王正祥. 工業微生物實驗技術手冊[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 1994.

          Zhu G J, Wang Z X. Technical manual of industrial microorganism experiment[M]. Beijing: China Light Industry Press, 1994.
          [38] Thomas G, Clay D, Magurran A. BIODAP-ecological diversity and its measurement[M]. New Brunswick: Fundy National Park, 2000.
          [39] Suh S O, Nguyen N H, Blackwell M. Yeasts isolated from plant-associated beetles and other insects: Seven novel Candida species near Candida albicans[J]. FEMS Yeast Research, 2008, 8(1): 88-102. DOI:  10.1111/j.1567-1364.2007.00320.x.
          [40] Zalar P, Gostin?ar C, de Hoog G S, et al. Redefinition of Aureobasidium pullulans and its varieties[J]. Studies in Mycology, 2008, 61: 21-38. DOI:  10.3114/sim.2008.61.02.
          [41] Mata-Gómez LC, Monta?ez J C, Méndez-Zavala A, et al. Biotechnological production of carotenoids by yeasts: An overview[J]. Microbial Cell Factories, 2014, 13(1): 1-12. DOI:  10.1186/1475-2859-13-12.
          [42] 周諧, 鄭堅, 黃書銘, 等. 三峽庫區重慶段浮游藻類調查及水質評價[J]. 中國環境監測, 2006, 22(4): 70-73. DOI:  10.19316/j.issn.1002-6002.2006.04.021. Zhou X, Zheng J, Huang S M, et al. Investigation and evaluation of pelagic algae and water quality about the Three Gorges Reservoir of Chongqing[J]. Environment al Monitoring in China, 2006, 22(4): 70-73.
          [43] 王致鵬. 產油酵母菌合成生物油脂的研究[D]. 青島: 中國海洋大學, 2014.

          Wang Z P. Lipid biosynthesis in some oleaginous yeasts[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2014.
          [44] 葉思特, 郭麗瓊, 劉曉蓉, 等. 產油微生物的篩選[J]. 華南農業大學學報, 2012, 33(3): 384-387. DOI:  10.3969/j.issn.1001-411X.2012.03.022. Ye S T, Guo L Q, Liu X R, et al. Screening of the oleaginous microorganisms[J]. Journal of South China Agricultural University, 2012, 33(3): 384-387.
          [45] 鐘琦, 吳慧昊, 代軍飛, 等. 響應面法優化油脂酵母發酵產油的影響因子[J]. 西北民族大學學報: 自然科學版, 2016, 37(2): 57-64. DOI:  10.14084/j.cnki.cn62-1188/n.2016.02.011. Zhong Q, Wu H H, Dai J F, et al. Optimize the factors oil-producing of yeast by response surface methodology[J]. Journal of Northwest University for Nationalities: Natural Science, 2016, 37(2): 57-64.
          [46] 謝鑫磊, 林源鋒, 魯昊, 等. 一株近平滑假絲酵母的分離, 鑒定和產油的研究[J]. 中國糧油學報, 2017, 32(10): 100-105. DOI:  10.3969/j.issn.1003-0174.2017.10.018. Xie X L, Lin Y F, Lu H, et al. Seperation, identification and oil production of a Candida parapsilosis Strain[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2017, 32(10): 100-105.
          [47] 楊旭. 油脂酵母的篩選及發酵產物的研究[D]. 太原: 山西大學, 2015.

          Yang X. The screen of lipid yeast and the research of fermented product[D]. Taiyuan: Shanxi University, 2015.
          [48] 張嘉, 沈丹虹, 鄭曉冬. 1 株高產油脂酵母菌株的誘變選育及其發酵條件研究[J]. 浙江大學學報: 農業與生命科學版, 2009, 35(5): 497-502. DOI:  10.3785/j.issn.1008-9209.2009.05.004. Zhang J, Shen D H, Zheng X D. Researches on m utation breeding and ferm entation conditions of oleaginous yeast[J]. Journal of Zhejiang University: Agric & Life Sci, 2009, 35(5): 497-502.
          [49] 周巧. 產油脂紅色酵母菌的研究[D]. 昆明: 昆明理工大學, 2013.

          Zhou Q. Studies on the lipid porduction of red yeasts[D]. Kunming: Kunming University of Science and Technology, 2013.
        • [1] 安忠琦詹偉吳慶珊方正王玉倩余天華翁慶北 . 金釵石斛根際可培養細菌多樣性及抑菌活性研究*. 云南大學學報(自然科學版), 2018, 40(3): 586-602. doi: 10.7540/j.ynu.20170673
          [2] 孫卉卉陳尚武李德美李曙馬會勤 . 云南彌勒產區水晶葡萄醪中酵母菌多樣性的研究. 云南大學學報(自然科學版), 2009, 31(1): 103-108 .
          [3] 姜怡杜冠華孫秋彭云霞李凌楓徐麗華 . 放線菌生物活性物質的高通量篩選. 云南大學學報(自然科學版), 2004, 26(4): 364-366.
          [4] 李紹蘭陳有為楊麗源方靄祺張玲琪尹惠瓊王璇 . 云南酵母菌的研究Ⅰ:西雙版納熱帶雨林中的酵母菌. 云南大學學報(自然科學版), 2002, 24(5): 378-380.
          [5] 姬秋彥畢研偉肖紅劍閆玲梅高丹丹李智華 . 重組腸激酶催化亞基在畢氏酵母中的高密度發酵、純化及活性鑒定. 云南大學學報(自然科學版), 2012, 34(S2): 426-431.
          [6] 李紹蘭陳有為楊麗源胡衛紅方靄祺 . 云南酵母菌的研究Ⅱ:白馬雪山自然保護區的酵母菌. 云南大學學報(自然科學版), 2002, 24(6): 469-470,477.
          [7] 楊本壽姜國銀曹云莉左祥周俊萍楊德 . 三株飛龍斬血內生細菌的分離鑒定與抑菌活性檢測. 云南大學學報(自然科學版), 2013, 35(S1): 89-93. doi: 10.7540/j.ynu.2013a19
          [8] 王傳旭于慧瑛趙愛華李新 . 一株鹽湖芽孢桿菌AF-1的鑒定及其抗尖孢鐮刀菌活性研究. 云南大學學報(自然科學版), 2019, 41(1): 164-171. doi: 10.7540/j.ynu.20170347
          [9] 陳義光姜怡崔曉龍李文均唐蜀昆文孟良姜成林徐麗華 . 具抗腫瘤活性中度嗜鹽菌YIM 80186的分離和系統發育分析. 云南大學學報(自然科學版), 2006, 28(5): 444-449.
          [10] 楊新洲徐嬋黃密鄭思建麻新華宋萍萬定榮 . 佛甲草細胞毒活性成分研究. 云南大學學報(自然科學版), 2016, 38(1): 127-132. doi: 10.7540/j.ynu.20150406
          [11] 李文均姜怡王棟Reiner M Kroppenstedt徐麗華姜成林 . 1株具抑制一氧化氮合成酶活性放線菌菌株的分離和鑒定. 云南大學學報(自然科學版), 2004, 26(3): 256-260.
          [12] 李萍馬莉奚家勤方敦煌楊發祥莫明和 . 放線菌BJLSH9菌株兼抗線蟲及煙草疫霉菌的生防活性及其殺線蟲代謝產物鑒定. 云南大學學報(自然科學版), 2012, 34(5): 590-595.
          [13] 許超德李紹蘭楊麗源周斌李治瀅張琦陳有為 . 幾株云南野生隱球酵母菌的分類研究. 云南大學學報(自然科學版), 2004, 26(1): 75-79.
          [14] 毛紹春李竹英 . 山竹果殼色素抗氧化活性研究. 云南大學學報(自然科學版), 2012, 34(S1): 77-80.
          [15] 武彥輝楊靜原倩倩李娟玲梅雪峰李小龍眭華梅 . 樹莓干果粗黃酮純化和活性研究. 云南大學學報(自然科學版), 2016, 38(4): 676-682. doi: 10.7540/j.ynu.20150767
          [16] 楊新洲呂靜南徐嬋林親雄楊靜汪超宋萍 . 鬼箭錦雞兒細胞毒活性成分研究. 云南大學學報(自然科學版), 2015, 37(1): 134-139. doi: 10.7540/j.ynu.20140364
          [17] 薛寒張琦李秋鵬季秀玲魏云林林連兵 . 棲熱菌噬菌體TSP4密碼子偏嗜性及其對基因異源表達的影響. 云南大學學報(自然科學版), 2012, 34(1): 107-112,119.
          [18] 陳金全王風平 . 珠江口海岸帶沉積物甲烷相關古菌群落結構及多樣性研究. 云南大學學報(自然科學版), 2013, 35(2): 240-245. doi: 10.7540/j.ynu.20120172
          [19] 周峻沛鄒長松顧英琦莫明和 . 16S rDNA-RFLP方法分析抑菌土中的細菌多樣性. 云南大學學報(自然科學版), 2007, 29(4): 424-429,432.
          [20] 楊君如余巍朱玉婷李方芳趙琦華謝明進 . 一個基于席夫堿配體的Mn(Ⅱ)配合物的合成、結構表征及體外抗多重耐藥白色念珠菌的活性研究*. 云南大學學報(自然科學版), 2018, 40(3): 529-537. doi: 10.7540/j.ynu.20170586
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        出版歷程
        • 收稿日期:  2019-11-07
        • 錄用日期:  2020-07-16
        • 網絡出版日期:  2020-09-30
        • 刊出日期:  2020-11-10

        云南異龍湖可培養酵母菌多樣性及產胞外酶和油脂活性菌株篩選

          作者簡介:李治瀅(1969?),女,云南人,高級實驗師,主要研究方向為真菌分類及其應用
          通訊作者: 李紹蘭, shlli@ynu.edu.cn
        • 1. 云南大學 云南省微生物研究所,云南 昆明 650091
        • 2. 昆明學院 化學科學與技術系,云南 昆明 650214

        摘要: 異龍湖是富營養高原湖泊,對其酵母菌多樣性及產胞外酶和油脂活性菌株進行研究,了解酵母菌在異龍湖中的分布及探討酵母菌參與湖泊有機物的循環作用. 研究采用膜過濾平置法分離異龍湖水樣中的酵母菌,應用26S rRNA D1/D2區域序列分析和形態特征及生理生化指標相結合的方法對酵母菌進行鑒定,運用BIO-DAP分析酵母菌的多樣性,采用胞外酶定性篩選培養基進行產酶活性菌株篩選,利用蘇丹黑-B染色和DNS分光光度法測定殘糖含量相結合的方法篩選產油脂活性菌株. 結果表明:從異龍湖湖水中分離獲得288株酵母菌,歸屬26個屬41個種3個潛在的新類群;優勢種為Rhodotorula kratochvilovae、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、Candida tetrigidarumFilobasidium magnum;湖西水樣的酵母菌多樣性指數(H′)和物種豐富度比湖東低;大多數菌株至少具有1種胞外酶活性(主要是脂肪酶、果膠酶和淀粉酶活性);篩選獲得20株具有油脂活性的菌株,活性菌株主要分布在紅酵母屬(Rhodotorula). 研究表明異龍湖具有豐富的酵母菌多樣性,貯藏大量值得開發利用的酵母菌資源.

        English Abstract

        • 真菌在水生生態系統中作為分解者參與到有機物質的分解當中,同時在能量流動和營養物質循環的促進、以及介導有機物在食物網的轉換中扮演著重要的角色[1-2]. 淡水湖是酵母的重要棲息地[3]. 國外學者對巴西Lagoa Santa喀斯特高原的Olhos d'Agua湖[4]、阿根廷巴塔哥尼亞西北部的5個高山湖泊[5]、Nahuel Huapi湖[6]、Rio Agrio湖和Caviahue 湖水系[7]進行了酵母菌多樣性及其產胞外酶活性和抗氧化能力等的研究. 國內鄭曉吉等對天山冰川融水的可培養低溫酵母菌的多樣性及產酶開展了研究[8]. 本課題組對云南高原湖泊撫仙湖[9-12]、星云湖[11-13]、程海[14-15]、杞麓湖[16]、陽宗海[17-18]、洱海[18]和滇池[19]中湖水酵母菌的多樣性、產酶、產油脂及產類胡蘿卜素能力進行了系統研究,發現高海拔的淡水湖泊中不僅廣泛分布有酵母菌,而且貯藏大量有活性的酵母菌資源. 異龍湖是云南省九大高原湖泊之一,在云南省紅河哈尼彝族自治州的石屏縣境內(23°39′~23°42′N,102°30′~102°38′E),位于縣城東南3 km處,屬珠江流域南盤江水系. 異龍湖湖泊面積自1980年來呈現波動減少的趨勢,特別是在1995年后湖泊急劇萎縮,至2015年面積不足15 km2,相比1985年減小了近20 km2,同時湖泊蓄水量自2008年也呈現急劇減少. 因水位下降、水文改造等因素,現已成為閉流湖,水質為劣Ⅴ類[20].

          目前對異龍湖的藻類[21-22]、噬藻體[23]和大型水生植物[24]有相關報道,但未見對異龍湖中酵母菌的研究報道. 本研究對異龍湖酵母菌的多樣性及產胞外酶和油脂活性菌株進行首次報道,以探討酵母菌在異龍湖中參與有機物分解和養分循環中的作用,以及在富營養化水體中的凈化作用,挖掘和儲備有應用價值的酵母菌資源.

          • 2011年12月15日,沿著異龍湖湖心由東向西選取9個樣點進行水樣的采集,樣點的信息見表1. 采樣深度為水下30 cm,每個樣點采集2 份水樣,每份水樣采集1.0 L,裝在無菌塑料容器內避光保存,采樣當天帶回實驗室存放在4 ℃的冰庫中,次日對樣品進行處理.

            樣點編號采樣地點經度緯度
            YL-1壩心鎮以西湖心102°37′38″E23°39′29″N
            YL-2石缸村以西湖心102°37′27″E23°39′40″N
            YL-3沙咀村以西湖心102°37′5″E23°39′47″N
            YL-4小窩鋪村以西湖心102°36′28″E23°40′10″N
            YL-5龍灣廟村以北湖心102°35′54″E23°40′30″N
            YL-6大過細村以北湖心102°35′2″E23°40′39″N
            YL-7仁壽村與長咀村
            之間湖心
            102°34′10″E23°40′11″N
            YL-8仁壽村與白浪村
            之間湖心
            102°33′34″E23°40′15″N
            YL-9仁壽村以東湖心102°34′44″E23°41′19″N

            表 1  異龍湖的采樣點信息

            Table 1.  The basic information of sampling points in Yilong Lake

          • 酸化YM,RBCH和PDA培養基[13],所有培養基都用異龍湖的湖水配制.

          • 脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、植酸酶和蛋白酶培養基[11],果膠酶培養基[25].

          • 平板篩選培養基(YM)[13],搖瓶發酵篩選培養基[26].

          • 酵母菌的分離方法參照文獻[13]進行,將每份水樣充分搖勻后進行過濾,每個濾膜過濾水樣25 mL,每份水樣共過濾500 mL,每個樣點過濾水樣1000 mL. 待菌落生長后挑取單菌落劃線純化并采用斜面、冷凍干燥和甘油管保藏備用.

          • 形態和生理生化測試參照文獻[27]進行.

          • 酵母菌菌株的DNA提取、26S rRNA D1/D2 區域序列的PCR擴增和序列分析[13, 28-29];采用DNAStar軟件對序列進行人工校對,并將序列在GenBank核酸序列數據庫中進行同源序列搜索(BLAST search),選取與菌株親源關系較近的模式菌株,構建系統發育樹進行系統進化分析[30-32]. GenBank登錄號為MN700859~MN700899.

          • 根據酵母菌的26S rRNA D1/D2序列分析、形態和生理生化指標結果,結合文獻[27, 33-35],對酵母菌進行鑒定.

          • 產胞外酶活性菌株的篩選采用平板篩選的方法[11]. 先將供試菌株在YM斜面、25 ℃上活化24 h,將活化的菌株點植在胞外酶活性篩選平板培養基上,分別于25 ℃和5 ℃靜置培養5 d和21 d.

          • 將供試菌株在YM培養基、25 ℃靜置培養3 d,對酵母細胞進行蘇丹黑-B染色和鏡檢[36],以觀察到菌體脂肪粒有無作為篩選指標,著色能清晰觀察到脂肪粒的為產油脂酵母菌菌株.

          • 采用蘇丹黑-B染色法[33]和DNS分光光度法測定殘糖含量[37]篩選產油脂菌株.

            將平板篩選中獲得的產油脂酵母菌株在25 ℃活化2 d,接入發酵篩選培養基中進行發酵培養(7/25 mL三角瓶、25 ℃、150 r/min振蕩4 d). 終止發酵后分別收集菌體和發酵液. 菌體經蘇丹黑染色、鏡檢. 發酵液經離心后使用DNS分光光度法測定殘糖,結合脂肪粒大小及殘糖的濃度為篩選指標. 殘糖低、脂肪粒較大的菌株保留.

          • 采用分離頻率(IF)比較判斷酵母菌的優勢類群,酵母菌分離頻率(IF)=某一酵母菌種群的菌株獲得數/分離到的總酵母菌的菌株數×100%;應用BIO-DAP 軟件計算各樣點酵母菌Shannon-Wiener 多樣性指數(H′)和Simpson 多樣性指數(D),分析各樣點酵母菌的多樣性[38].

          • 從異龍湖的9個樣點湖水中分離獲得288株酵母菌,根據酵母菌的26S rRNA D1/D2序列分析、形態和生理生化指標結果將其中的280株進行分類鑒定,歸屬26個屬41個種3個潛在的新類群(表2). 對41個種的代表菌株與相應的模式菌株進行系統發育分析并構建系統發育樹(圖1),從圖1表2可見異龍湖酵母菌分布在擔子菌酵母、子囊菌酵母和類酵母中,其中以擔子菌酵母為主,其次是子囊菌酵母,類酵母最少. 從表2發現擔子菌酵母歸屬13個屬25個種2個潛在新類群共167株,分離頻率為57.99%;子囊菌酵母歸屬12個屬15個種1個潛在新類群共71株,分離頻率為24.65%;類酵母的分離頻率為14.58%,有1個屬1個種42株;在異龍湖的酵母菌中,優勢屬為紅酵母屬(Rhodotorula)、短梗霉屬(Aureobasidium)、線黑粉酵母屬(Filobasidium)和假絲酵母屬(Candida),分離頻率分別為28.13%、14.58%、11.11%和9.03%;優勢種為R. kratochvilovae(17.71%)、出芽短梗霉(A. pullulans)(14.58%)、C. tetrigidarum (7.29%)和F.magnum (6.94%);A. pullulans 在9個樣點中都有分布;子囊菌酵母主要分布在4個樣點(YL-1~YL-4),只有2株(2個種)分布在樣點YL-9中.

            圖  1  基于 26S rRNA D1/D2 區域序列構建的系統樹(Neighbor-Joining 法)

            Figure 1.  Phylogenetic tree drawn from Neighbor-Joining analysis based on the 26S rRNA D1/D2 domain sequence alignment

            種名采樣點合計分離頻率/%
            YL-1YL-2YL-3YL-4YL-5YL-6YL-7YL-8YL-9
            Basidiomycota yeasts
            Bullera alba 1 1 1 3 1.04
            Bullera sinensis 1 1 1 3 1.04
            Filobasidium floriforme 3 2 1 1 1 2 10 3.47
            Filobasidium magnum 1 5 2 9 1 2 20 6.94
            Filobasidium uniguttulatum 1 1 2 0.69
            Hannaella zeae 3 1 4 1.39
            Microstroma bacarum 1 1 0.35
            Naganishia albida 7 7 2.43
            Papiliotrema aspenensis 1 3 1 5 1.74
            Papiliotrema flavescens 4 1 2 7 2.43
            Papiliotrema fuscus 5 5 1.74
            Papiliotrema rajasthanensis 1 1 0.35
            Cryptococcus sp. 1 3 2 6 2.08
            Rhodotorula babjevae 1 1 0.35
            Rhodotorula glutinis 1 1 0.35
            Rhodotorula graminis 8 1 5 2 16 5.56
            Rhodotorula kratochvilovae 1 3 17 12 3 9 6 51 17.71
            Rhodotorula mucilaginosa 4 4 1.39
            Rhodotorula taiwanensis 1 1 5 7 2.43
            Rhodotorula sp. 1 1 0.35
            Saitozyma flava 2 2 0.69
            Sakaguchia dacryoidea 1 2 3 1.04
            Sampaiozyma ingeniosa 2 2 0.69
            Sampaiozyma vanillica 2 2 0.69
            Sporidiobolus pararoseus 1 1 0.35
            Sporobolomyces oryzicola 1 1 0.35
            Symmetrospora marina 1 1 0.35
            Ascomycota yeasts
            Barnettozyma californica 10 1 4 15 5.21
            Candida railenensis 1 1 0.35
            Candida tetrigidarum 1 3 4 13 21 7.29
            Candida tropicalis 1 1 0.35
            Candida sp. 1 1 1 3 1.04
            Clavispora lusitaniae 1 1 0.35
            Debaryomyces nepalensis 1 1 0.35
            Diutina catenulata 4 1 5 1.74
            Geotrichum bryndzae 1 2 3 1.04
            Hanseniaspora uvarum 2 2 0.69
            Lodderomyces elongisporus 1 1 0.35
            Meyerozyma guilliermondii 1 1 2 0.69
            Pichia cactophila 3 3 6 2.08
            Pichia kudriavzevii 1 1 2 0.69
            Saturnispora silvae 3 3 6 2.08
            Wickerhamomyces anomalus 1 1 0.35
            Yeast-like taxa
            Aureobasidium pullulans 8 8 2 3 1 2 1 14 3 42 14.58
            Unidentified 2 4 1 1 8 2.78
            合計 43 42 38 64 29 16 14 29 13 288
            物種豐富度 17 14 18 20 10 4 5 6 5
            香農指數 (H) 2.48 2.21 2.71 2.65 1.56 0.82 1.33 1.32 1.38
            辛普森指數 (D) 0.089 0.127 0.051 0.080 0.342 0.558 0.275 0.318 0.244

            表 2  異龍湖湖水各樣點酵母菌種群分布

            Table 2.  The distribution of yeast species at sample-sites in Yilong Lake

            表2結果顯示,比較異龍湖9個湖水樣點酵母菌的物種豐富度,小窩鋪村以西的樣點YL-4最高,其次是沙咀村以西的樣點YL-3和壩心鎮以西的樣點YL-1,最低的是大過細村以北的樣點YL-6. 對各個樣點的酵母菌多樣性分析,發現Shannon-Wiener 多樣性指數(H′)最高的是樣點沙咀村以西的樣點YL-3,最低的是大過細村以北的樣點YL-6. Simpson多樣性指數(D)最高的是大過細村以北的樣點YL-6,最低的是沙咀村以西的樣點YL-3.

          • 本研究對分離獲得的288株酵母菌進行了6種胞外酶(脂肪酶、果膠酶、淀粉酶、纖維素酶、植酸酶和蛋白酶)、2種溫度(25 ℃和5 ℃)的活性篩選. 表3結果顯示,在2種溫度篩選條件下共有82株酵母菌(占總菌數的28.47%)在本次研究中至少產生1種及1種以上胞外酶,其中擔子菌酵母60株,子囊菌酵母13株,類酵母6株. 25 ℃條件下,篩選到70株酵母菌至少能產生1種胞外酶,擔子菌酵母、子囊菌酵母和類酵母分別占有57株、8株和3株;活性菌株以R. kratochvilovaeF. magnum為主;在活性菌株中,產生胞外脂肪酶的菌株最多,其次是產果膠酶的菌株和淀粉酶的菌株,產植酸酶、纖維素酶和蛋白酶活性的菌株少;產脂肪酶的菌株以F. magnum和禾本紅酵母(R. graminis)為主;產果膠酶的菌株主要分布在R. kratochvilovaeF. magnum;R. kratochvilovae是產淀粉酶的優勢菌株;產纖維素酶的菌株只出現在N. albidaBar. californica;產植酸酶的菌株在R. kratochvilovae, F. magnumPa. aspenensis中分布;只有C. tetrigidarum和臺灣紅酵母(R.taiwanensis)的菌株產生胞外蛋白酶. 在5 ℃條件下產胞外淀粉酶的菌株居多,未篩選到產胞外纖維素酶的菌株;產胞外淀粉酶菌株以Bar. californicaA. pullulans菌株為主;25 ℃條件下產胞外酶的活性菌株數量及種群明顯多于5 ℃.

            種名25 ℃5 ℃合計
            ABCDEF小計ABCDEF小計
            Basidiomycetous yeasts
            Cryptococcus sp. 1 1 1 0 1
            Filobasidium floriforme 1 1 1 0 1
            Filobasidium magnum 12 5 2 1 12 0 12
            Filobasidium uniguttulatum 1 1 0 1
            Hannaella zeae 2 1 2 0 2
            Naganishia albida 4 3 2 5 0 5
            Papiliotrema aspenensis 3 2 1 4 0 4
            Papiliotrema flavescens 4 1 4 0 4
            Papiliotrema fuscus 2 2 2 0 2
            Rhodotorula glutinis 1 1 1 0 1
            Rhodotorula graminis 7 1 1 8 1 1 1 1 1 8
            Rhodotorula kratochvilovae 8 5 3 14 1 1 1 15
            Rhodotorula taiwanensis 1 1 1 0 1
            Saitozyma flava 1 1 0 1
            Sakaguchia dacryoidea 0 1 1 1
            Sampaiozyma vanillica 0 1 1 1 1 1 1 1
            Ascomycetous yeasts
            Barnettozyma californica 1 2 1 1 3 1 3 3 6
            Candida tetrigidarum 1 1 2 0 2
            Candida tropicalis 1 1 0 1
            Debaryomyces nepalensis 1 1 0 1
            Diutina catenulata 1 1 0 1
            Geotrichum bryndzae 0 1 1 1 1 1
            Lodderomyces elongisporus 0 1 1 1
            Yeast-like taxa
            Aureobasidium pullulans 1 2 1 3 2 2 3 2 3 6
            Unidentified 1 1 2 1 1 1 3
            合計 42 30 16 3 5 2 70 5 6 12 0 3 3 13 82
            A:脂肪酶活性;B:果膠酶活性;C:淀粉酶活性;D:纖維素酶活性;E:植酸酶活性;F:蛋白酶活性.

            表 3  異龍湖酵母菌的胞外酶活性

            Table 3.  Extracellular enzymatic activities of yeasts from Yilong Lake

          • 將從異龍湖湖水樣品中分離獲得的288株酵母菌經平板和搖瓶篩選,結果篩選到20株殘糖低于2%、脂肪粒較大的菌株(表4),擔子菌酵母和子囊菌酵母分別有15株和5株. 擔子菌酵母以Rhodotorula為主(11株),隱球酵母屬(Cryptococcus), FilobasidiumPapiliotrema也有分布;Rhodotorula中主要分布在R. taiwanensis(4株), R. kratochvilovae(3株)和R. graminis(3株);子囊菌酵母分布在Bar. californica, C. railenensis, 季也蒙畢赤酵母(M. guilliermondii)和庫德畢赤酵母(P. kudriavzevii). 此次研究未在類酵母中篩選獲得殘糖低于2%、脂肪粒較大的菌株.

            菌株編號種名殘糖/%菌株編號種名殘糖/%
            Basidiomycetous yeastsAscomycetous yeasts
            Ym26448Cryptococcus sp.1.01Ym26336Barnettozyma californica0.58
            Ym26410Filobasidium magnum0.61Ym26343Barnettozyma californica1.11
            Ym26423Papiliotrema aspenensis0.84Ym26496Candida railenensis0.91
            Ym26369Papiliotrema flavescens1.22Ym26318Meyerozyma guilliermondii0.81
            Ym26338Rhodotorula glutinis1.11Ym26358Pichia kudriavzevii1.38
            Ym26316Rhodotorula graminis1.13
            Ym26319Rhodotorula graminis0.95
            Ym26444Rhodotorula graminis1.02
            Ym26443Rhodotorula kratochvilovae0.81
            Ym26450Rhodotorula kratochvilovae1.42
            Ym26466Rhodotorula kratochvilovae1.00
            Ym26359Rhodotorula taiwanensis0.25
            Ym26388Rhodotorula taiwanensis0.34
            Ym26400Rhodotorula taiwanensis0.43
            Ym26427Rhodotorula taiwanensis0.35

            表 4  異龍湖產油脂酵母菌篩選結果

            Table 4.  Initial screening results of lipid–producing yeasts from Yilong Lake

          • 從異龍湖湖水中分離獲得288株酵母菌,歸屬26個屬41個種3個潛在的新類群,與云南高原湖泊同水系的撫仙湖[9]、星云湖[13]、陽宗海[17-18]和札麓湖[16] 進行比較,酵母菌種群在屬級水平上異龍湖居首(26個屬),杞麓湖的最少(14個屬);酵母菌種群數量撫仙湖最多(52個種),其次分別是陽宗海(48個種)、異龍湖(41個種)、星云湖(37個種)和杞麓湖(27個種);5個湖泊共有的酵母菌種群只有N. albida、Pa. flavescens、粘紅酵母(R. glutinis)、膠紅酵母(R. mucilaginosa)、異常威克漢姆酵母(W. anomalus)、P. kudriavzeviiA. pullulans共7個種;異龍湖特有的種16個. 這5個湖泊雖同屬珠江水系,但因地理位置、水體等環境因素的不同造成酵母菌物種多樣性的明顯差異. 與位于巴西 Karstic高原湖泊—阿古亞湖(Lagoa Olhos d'Agua)[4]相比,2個湖泊均是富營養湖泊,地理位置相距遙遠,但它們也存有共同的酵母菌種9個:A. pullulans, W. anomalus, 有孢漢遜酵母(Han. uvarum), Diu. catenulate, Sai. flava, R. mucilaginosa, R. graminis, R. glutinisN. albida;各自特有的種分別是32個(異龍湖)和31個(Lagoa Olhos d'Agua);Candida是它們共有的優勢類群,其中C. tetrigidarum和無名假絲酵母(C. famata)(修訂為漢遜德巴利酵母D. hansenii)分別是異龍湖和Lagoa Olhos d'Agua的優勢種群.

            Candida能夠對污染環境起到一定的指示作用,C. tetrigidarum生活在甲蟲的腸道中[39],異龍湖中高頻率出現C. tetrigidarum,可能是跟異龍湖周圍大量發展漁業,產生漁業生產廢水有關. A. pullulans經常以低頻率從各種水樣中分離出來,與植物和土壤有關[4],但其在異龍湖、撫仙湖[9]、杞麓湖[16]和陽宗海[17-18]的水體中以高頻率且分布廣的情況出現,可能因為高原湖泊中殘留有腐敗的植物,以及A. pullulans在高原湖泊中產生黑色素可抵御紫外線的照射[40],能在高海拔的湖泊中大量生存;R. mucilaginosa, R. kratochvilovaeR. glutinis在高原湖泊不僅分布廣,而且在高原湖泊中高頻率出現,研究表明這些酵母菌在水生環境中普遍存在,能產生抵御紫外線的類胡蘿卜素[10, 13, 41],因此能在高紫外線下的高原湖泊中廣泛生存且大量繁殖.

            Shannon-Wiener 多樣性指數(H′)可用于評價水體污染狀況,即當H′≥3時,表示水質清潔;當3 > H′≥2時,表示輕度污染;當2 > H′≥1時,表示中度污染;當1 > H′≥0 時,表示水重度污染[42]. 異龍湖酵母菌Shannon-Wiener 多樣性指數(H′)分析結果表明異龍湖湖西的污染程度比湖東的嚴重. 物種的豐富度表現出湖東比湖西明顯豐富. 湖西上游區為石屏縣縣址,是人類活動密集區,產生大量的城市生活污水和工業廢水,城市生活污水和工業廢水會通過河道、地表徑流匯入湖里. 湖體東部遠離城市,周圍是農田和村莊,主要是面源污染,農業生產污水、農村生活廢水和降雨地面徑流造成的污染,所以污染程度比湖西的較小.

          • 異龍湖供試的288株酵母菌有82株至少產生1種及1種以上的胞外酶. 活性菌株的種群和數量25 ℃的明顯高于5 ℃,這與譚金連等對撫仙湖和星云湖酵母菌胞外酶活性的研究結果恰好相反[11-12],同時呈現產胞外脂肪酶的菌株最多,產蛋白酶的菌株最少,與阿根廷學者Brand?o等對阿根廷韋爾瓦皮湖的酵母菌胞外酶活性的篩選結果相同[6],這種現象可能由酵母菌對湖泊環境的應答和適應能力所決定. 與其他學者對高原湖泊酵母菌的胞外酶活性篩選結果[6, 11-13, 15, 17-19]比較,在異龍湖酵母菌中也廣泛分布有產脂肪酶、果膠酶、淀粉酶、纖維素酶、植酸酶和蛋白酶活性的菌株,說明高原湖泊中廣泛存在能夠水解天然化合物(脂類、淀粉、蛋白質和果膠等)的酵母菌,參與湖泊的有機物循環,在有機物分解和養分循環中具有重要的生態作用.

            異龍湖酵母菌有5株(A. pullulans 2株,Sam. vanillica, R. graminisG. bryndzae各1株)能在5 ℃下分別能產生3~5種胞外酶,同時R. graminis菌株在25 ℃下還能產生胞外脂肪酶,這5株酵母菌在下一步的工作中需對其產酶條件進行優化,可為開發利用提供良好的種質資源.

            在異龍湖具有產胞外酶活性的子囊菌酵母中,菌種Bar. Californica有6株具有胞外酶活性,在25 ℃和5 ℃各有3株,在25 ℃產胞外酶的3株:1株產胞外脂肪酶、果膠酶和纖維素酶,1株產淀粉酶,1株產果膠酶;在5 ℃產酶的3株:1株產果膠酶和淀粉酶,2株只產淀粉酶. 在擔子菌酵母中,有12株F. magnum具有胞外酶活性,并且只在25 ℃下具有產酶能力,均能產胞外脂肪酶;在12株活性菌株中有7株僅產胞外脂肪酶;有5株除能產脂肪酶外,其中有2株能還能產果膠酶,2株產果膠酶和淀粉酶,1株產果膠酶和植酸酶. R. graminis有8株產胞外酶,在25 ℃下都具有產酶活性,其中有1株在25 ℃和5 ℃均有產酶能力. 其中25 ℃下6株只產胞外脂肪酶,有1株能產果膠酶和淀粉酶;有1株在25 ℃下產脂肪酶,同時在5 ℃下能產脂肪酶、果膠酶、淀粉酶和植酸酶. 有15株R. kratochvilovae具有產酶活性,其中在5 ℃下只有1株具有產酶能力,產果膠酶和淀粉酶;14株均在25 ℃下有產酶活性,6株只產果膠酶,4株產淀粉酶,2株產植酸酶,1株產果膠酶和淀粉酶,1株產果膠酶和植酸酶. 類酵母A. pullulans有6株具有產酶活性,在25 ℃和5 ℃各有3株;有2株的產酶活性相同,只在5 ℃下具有產酶活性,能產脂肪酶、果膠酶、淀粉酶和蛋白酶;其余4株的產酶活性都不相同,有2株在25 ℃下分別只產脂肪酶和果膠酶,有1株在25 ℃下同時能產果膠酶和淀粉酶,有1株只能在5 ℃下產淀粉酶. 表明在異龍湖酵母菌產酶活性菌株中,同種不同株的酵母菌其產酶活性都有差異.

          • 對異龍湖的288株酵母菌進行產油脂能力篩選,結果殘糖低于2%、脂肪粒較大的菌株共有20株,歸屬于8個屬11個種. 研究報道常見的產油酵母有粘紅酵母(R. giutinis),圓紅酵母(R. toruloides),沼澤生紅冬孢酵母(Rh. Paludigenum), A. pullulans,斯達氏油脂酵母(Lip. starkeyi), M. guilliermondii, N. albida, Cut. curvatum, R. mucilaginosa,發酵地霉(G. fermentans),熱帶假絲酵母(C. tropicalis)和解脂亞羅威亞酵母(Y. lipolytica)[43],以及Mey. caribbica[44], Cut. mucoides[45],近平滑假絲酵母C. parapsilosis[46],白色假絲酵母(C. albicans)[47]和子囊菌油脂酵母(Lip. tetrasporus)[48];實驗室從紅色酵母中篩選到高產油脂的酵母菌13株(3株分離自云南高原湖泊程海湖周圍的酸模植物,10株分離自程海湖湖水),這些菌株分布于R. graminis,Spo. pararoseusR. kratochvilovae,對其產產油脂發酵條件進行優化,結果從湖水中獲得的2株R. kratochvilovae油脂產量分別可達60.2%和 58.5%[49]. 在異龍湖的產油脂酵母菌中分布有曾報道的產油脂酵母R. graminis, R. kratochvilovae, R. glutinis和季也蒙畢赤酵母M. guilliermondii,還分布有未見報道的R. taiwanensis, F. magnum, Pa. aspenensis, Pa. flavescens, Bar. californica, C. railenensisP. kudriavzevii. 說明在異龍湖中廣泛分布有產油脂的酵母菌種群. 獲得的20株產油脂酵母菌有望在以后的工作中進行產油脂發酵和提取條件的優化,甚至利用基因遺傳改造、調控油脂代謝途徑,為微生物油脂的工業化生產提供新的菌種資源.

          • 從異龍湖的湖水中分離獲得288株酵母菌,歸屬26個屬41個種3個潛在的新類群,種群豐富,多樣性指數(H′)結果表明異龍湖湖西的污染程度比湖東的嚴重,高頻率出現C. tetrigidarum驗證了異龍湖周圍大量發展漁業,產生漁業生產廢水進入湖中帶來的不良后果. 因此對異龍湖酵母菌多樣性的研究可作為異龍湖湖水富營養化生物監測的方法之一.

            異龍湖酵母菌中有82株至少產生1種及1種以上的胞外酶,說明異龍湖中廣泛分布具有胞外酶活性的菌株,有5株能在低溫下產3~5種胞外酶;獲得具有值得進一步研究的產油脂能力菌株20株,菌株種群分布廣,歸屬于8個屬11個種,其中未曾有報道的7個種. 在以后的研究中需對這些活性菌株的產酶產脂條件進行優化,利用基因遺傳改造技術和調控代謝途徑,以期獲得高產酶和高產油脂的酵母菌,為工業生產提供新的菌種資源.

        參考文獻 (49)

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